顯微鏡的光學(xué)性能

顯微鏡的光學(xué)性能由下列八個基本光學(xué)參數(shù)（或參量）來決定:

（一）數(shù)值孔徑
數(shù)值孔徑又叫鏡口率。它是指所觀察的物體與鏡頭間介質(zhì)的折射率n與物鏡鏡口角α一半的正弦值的乘積。用N.A或A.來表示。即： N.A.＝nsin（α/2）
所謂鏡口角是指被觀察點射入物鏡前透鏡的邊緣光線之間的夾角。

數(shù)值孔徑是物鏡與聚光鏡的重要參數(shù)，與顯微鏡的其它各個光學(xué)參數(shù)都有密切關(guān)系。一般希望它越大越好。從公式中可知：提高數(shù)值孔徑有兩種方法，一是增大鏡口角，二是增大物鏡與標(biāo)本之間的折射率。
采取前一種方法時，可以讓標(biāo)本與物體盡量靠近。但無論怎樣靠近，α總是小于180°。這樣，sin（α/2）也小于１。而空氣的折射率n＝1。因此，干燥系物鏡的數(shù)值孔徑nsin（α/2）總是小于1，一般在0.04～0.95之間。
采取后一種方法時，可在物鏡與標(biāo)本之間加入折射率較大的介質(zhì)。如香柏油的折射率n＝1.515，使用香柏油為介質(zhì)時，可使數(shù)值孔徑達(dá)到1.2以上。這就是為什么在有些情況下要使用油鏡的原因。目前油鏡所能達(dá)到的最大數(shù)值孔徑為1.4。

（二）分辨率
分辨率又叫鑒別率或分辨本領(lǐng)。所謂分辨率是指顯微鏡分辨被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu)的能力。它與分辨距離成反比。分辨距離是指能被分辨開的兩物點間的最小距離。分辨距離越小，顯微鏡的分辨率越高。如果兩物點間的距離小于分辨距離，就會把兩點誤看成一點，無法看清其結(jié)構(gòu)。顯微鏡的分辨率是由物鏡決定的。目鏡只起放大作用，不能增加顯微鏡的分辨率。
在普通中心照明的情況下，物鏡的分辨距離ｄ由下式?jīng)Q定。
ｄ＝（λ/2）N.A.
式中：ｄ表示分辨距離, 單位是微米，λ表示照明光線的波長，單位也是微米。
在可見光中，亮度最大而且對人眼最敏感的波長為0.55μm，物鏡最大的N. A.為1.4。代入上式可得ｄ近似為0.2μm。即，使用普通光學(xué)顯微鏡，在中心照明的情況下，分辨距離的極限為0.2μm。也就是說，小于0.2μm的兩物體，普通光學(xué)顯微鏡無法區(qū)分。
使用紫外線，可以減小照明光線的波長，能使分辨距離達(dá)到0.1μm。但因紫外線不能為人眼所見。只能拍成照片后再觀察。
電子流的波長只有0.00387nm。利用“電子透鏡”或磁透鏡來控制電子流，所制成的電子顯微鏡的分辨距離達(dá)零點幾nm?？梢杂盟ビ^察原子的結(jié)構(gòu)。

（三）放大率
顯微鏡的放大率等于物鏡的放大率和目鏡的放大率的乘積。從原理上講，放大率可以做的非常大。但是，如果標(biāo)本的細(xì)節(jié)不能被物鏡分辨開來，放大的再大，也毫無意義。理論上可以推導(dǎo)出來，顯微鏡最合適的放大率（稱為有效放大率，用Ｍ有效表示）是在物鏡的數(shù)值孔徑的500～1000倍之間。即500N.A.≤Ｍ有效≤1000N.A.
在有效放大率范圍內(nèi)，眼睛可以長時間觀察而不易疲勞。如果放大率低于500 N.A.，觀察起來就很吃力。如果高于1000N.A.，則會使像質(zhì)變壞，甚至造成不真實的像。因此，超過1000N.A.的放大率稱為無效放大率。

（四）工作距離
工作距離是指顯微鏡調(diào)焦后，在使用標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片和標(biāo)準(zhǔn)機械筒長的情況下，物鏡的下表面至蓋玻片上表面之間的距離。物鏡的放大率越高，工作距離越短。一般10倍以下的低倍物鏡，工作距離為5～7mm，而100倍的油鏡，其工作距離只有0.19mm左右。

（五）焦點深度
當(dāng)顯微鏡調(diào)焦于標(biāo)本中某一平面后，不僅這一物平面可以看清楚，而且和它相連的上下兩個物平面也能同時看清楚。這上下兩個物平面之間的距離叫做焦點深度，簡稱焦深。
顯微鏡的焦深是很小的，而且數(shù)值孔徑越大、總放大率越大，焦深越小。例如，使用N.A.為1.25/100倍的油鏡、12.5倍的目鏡觀察時，焦深只有0.27μm。這就是說，調(diào)焦后一次只看清楚0.27μm厚的一個薄層。而普通標(biāo)本一般都有幾個微米厚。要想看完整個標(biāo)本，需要使用顯微鏡的微調(diào)機構(gòu)，自上而下分層觀察。

（六）清晰度
顯微鏡成像的清晰度取決于其光學(xué)系統(tǒng)，尤其是物鏡的光學(xué)性能。它與顯微鏡的設(shè)計、制造、使用和保管都有關(guān)系。是一個很重要而又很復(fù)雜的問題。從使用和保管的角度來說，影響清晰度的主要原因有：所使用的蓋玻片的厚度不合格、調(diào)焦沒有調(diào)到理想位置、總放大率用得過大、油鏡的鏡頭沒有擦干凈、鏡片生霉等。

（七）鏡像亮度
鏡像亮度是指顯微鏡中所看到的物像的亮暗程度。為了便于觀察，我們希望所成的像亮一些。在外部光線不變的情況下，鏡像亮度與數(shù)值孔徑的平方成正比，而與總放大率的平方成反比。要想使鏡像亮度大些，應(yīng)使用大數(shù)值孔徑的物鏡，配以低放大率的目鏡。例如，在物鏡相同的情況下，使用5倍的目鏡與使用10倍的目鏡相比，其鏡像亮度要大4倍。
使用電光源的顯微鏡，其鏡像亮度可以通過調(diào)節(jié)照明燈的亮度來控制。

（八）視場

視場又叫視野。是指顯微鏡一次能夠看到的被檢物體的范圍。通常我們希望視場盡可能大些。顯微鏡的視場由物鏡的視場和目鏡的視場共同決定的。普通物鏡的視場小于20mm，大的可達(dá)40mm以上。普通10倍目鏡的視場為14mm，大的可達(dá)24mm以上。物鏡與目鏡一旦設(shè)計好后，其視場便固定了。因一般顯微鏡的視場較小，不可能在一個視場內(nèi)看到整個標(biāo)本，只能看到標(biāo)本上極小的一個小圓塊。而且視場的大小與顯微鏡的總放大率成反比?？偡糯舐试酱?，視場越小。解決的辦法是利用移動器，使標(biāo)本的各部分依次進入視場，輪流觀察。
上述八個參數(shù)之間是互相聯(lián)系、互相制約的。例如，使用數(shù)值孔徑大的物鏡，其分辨率、放大率、鏡像亮度都大，對觀察有利。但它的工作距離短、焦點深度和視場小，使用起來不太方便。在使用中應(yīng)根據(jù)具體使用情況，照顧重點，兼顧其他。使用顯微鏡的根本目的是要看清楚樣本的細(xì)節(jié)，否則，就失去了使用顯微鏡的意義。從這個前提條件看來，分辨率應(yīng)擺在首位，放大率擺在第二位。其余各參數(shù)應(yīng)列入從屬地位。因為前兩個參數(shù)是決定被檢物體能否看得見的問題。其余各參數(shù)只是決定使用方便不方便或觀察效果好不好的問題。因此，使用時，應(yīng)在保證主要參數(shù)滿足要求的前提下，適當(dāng)兼顧其余各參數(shù)。